流式细胞凋亡检测服务

　　流式细胞凋亡检测服务通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。

　　流式细胞凋亡检测服务(One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit)为您提供了一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于经过固定和洗涤的细胞或组织，只要经过一步染色反应，洗涤后就可以通过荧光显微镜或流式细胞凋亡检测服务检测到呈现绿色荧光的凋亡细胞。

　　细胞凋亡(apoptosis)是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。具体表现为：出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等.

　　细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时

　　抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase,TdT)的催化下加上绿色荧光探针荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞凋亡检测服务进行检测，这就是TUNEL法检测细胞凋亡的原理。注：FITC是fluorescein isothiocyanate的缩写，实际上大多数情况下所谓的FITC即为fluorescein。

　　有如下优点：

　　(1)高灵敏度：背景染色极低，阳性染色明亮，可以在单细胞水平检测到细胞凋亡，同时由于凋亡早期就有DNA断裂，可以检测到早期的细胞凋亡。

　　(2)特异性：TUNEL检测时通常更容易标记凋亡细胞，而不容易标记坏死细胞。

　　(3)快速：仅需约1-2个小时即可完成。

　　(4)方便：只需一步染色反应，洗涤后即可观察，不必使用二抗等进行多步操作。

　　(5)应用范围广：可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

　　TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂(和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。

　　极少数细胞凋亡时没有DNA断裂，此时不适用TUNEL法检测。在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳性。在需要严格判断细胞凋亡的情况下，同时检测多个凋亡指标。

　　细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death ,PCD）是细胞的生命现象之一，它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞凋亡检测服务或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

　　流式细胞凋亡检测服务与流式细胞凋亡检测服务实验步骤相近：

　　1.  凋亡细胞的制备

　　小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg体重，10 h后解剖取胸腺，分离胸腺细胞。用PBS洗两遍，调整待测细胞的浓度为2×106 /ml，备用。

　　2.  200 μl细胞悬液加入1 ml冷PBS，轻轻震荡使细胞悬浮，1000 rpm 4 ℃离心10 分钟，弃上清。

　　3.  重复步骤2两次。

　　4.  将细胞重悬于200 μl 标记缓冲液。

　　流式细胞凋亡检测服务和流式细胞凋亡检测服务注意事项：

　　1.  整个操作过程动作要尽量轻柔，切勿用力吹打细胞，尽量在4 ℃下操作。

　　2.  反应完毕后要尽快检测，因为细胞凋亡是一个动态的过程，反应一小时后荧光强度就开始衰变。

　　3.  Annexin V-FITC是光敏物质，在操作时要注意避光。

　　流式细胞凋亡检测服务如何避免出现假阳性结果？细胞接种不易过密：接种对数生长期的细胞时密度不要＞1*106，以免细胞培养过程中自身引起凋亡，而非外界处理因素；

　　避免消化过度：因消化过度可能会造成PS外翻，得到假阳性的结果。因此消化时最好用低浓度胰酶消化，轻柔吹打贴壁细胞2-3次，尽量把胰酶造成损伤可以控制在5%以内，加上对照组的情况下对实验结果不会造成明显影响；

　　操作尽量轻柔：收集细胞时力度过大很可能造成细胞膜损伤，导致细胞膜的磷脂层暴露，从而结合Annexin V，导致假阳性，因此处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤。

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